酵母水解物中小肽的測定方法及意義

　　酵母中含有三類大分子：蛋白質、核酸和多糖，其中蛋白質幾乎占了干物質一半以上的含量，必需氨基酸充足，呈味氨基酸豐富，總谷氨酸含量在6%以上，色氨酸在1%以上，所以酵母水解物誘食性絕佳。

　　新鮮酵母中的蛋白質經(jīng)水解后產(chǎn)生的肽類物質，曾引起專家和配方師們的廣泛關注與討論，那么酵母水解物中的小肽具體含量應該是多少?是否可以精確、重復檢測?以下內容是由湖北海宜為大家整理的小肽的定義及檢測方法：

　　一、什么是小肽?

　　肽是蛋白質降解為游離氨基酸過程中的中間產(chǎn)物，通常將大于20個的氨基酸殘基構成的肽稱為多肽(Poly-peptide)，2-20個氨基酸殘基構成的肽稱為寡肽(Oligopeptide)，而將僅由2個或3個氨基酸殘基構成的二肽和三肽稱之為小肽(Small peptide)。(參考《動物營養(yǎng)學》第三版)

　　二、小肽含量的檢測方法：

　　1、大豆肽粉，國標：GB/T 22492-2008

　　原理：采用高效凝膠過濾色譜法測定。即以多孔性填料為固定相，依據(jù)樣品組分相對分子質量大小的差別進行分離，在肽鍵的紫外吸收波長220nm條件下檢測，使用凝膠色譜法測定相對分子質量分布的專用數(shù)據(jù)處理軟件(即GPC軟件)，對色譜圖及其數(shù)據(jù)進行處理，計算得到大豆肽的相對分子質量大小及分布范圍。

　　本法適用于以大豆粕或大豆蛋白等為原料，用酶解或微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的，相對分子質量在5000以下，主要成分為肽的粉末狀物質。

　　2、海洋魚低聚肽粉，中國輕工行業(yè)標準：QB/T 2879-2007

　　2.1  低聚肽

　　方法原理：低分子量的蛋白質水解物(包含低聚肽及游離氨基酸)可溶于三氯乙酸溶液;高分子質量的蛋白質在三氯乙酸溶液中易沉淀。樣品經(jīng)三氯乙酸溶液溶解后，離心分離出沉淀蛋白質，收集離心清液。按照GB/T5009.5規(guī)定的方法測定離心清液的酸溶蛋白質水解物含量，清液的酸溶蛋白質水解物含量減去游離氨基酸含量即得到低聚肽的含量。

　　該法僅可以粗略測出樣品中的三氯乙酸可溶性氮，并且不能扣除核酸中的含氮堿基對檢測結果的干擾，更加不能精確檢測二肽、三肽具體含量是多少。

　　2.2  相對分子質量小于1000u的蛋白質水解物所占比例(高效凝膠過濾色譜法)

　　方法原理：相對分子質量小于1000u的蛋白質水解物(包括低聚肽和少量游離氨基酸)所占比例，采用高效凝膠過濾色譜法測定。即以多孔性填料為固定相，依據(jù)樣品組分分子體積大小的差別進行分離，在肽鍵的紫外吸收波長220nm條件下檢測，使用凝膠色譜測定相對分子質量分布的專用數(shù)據(jù)處理軟件(即GPC軟件)，對色譜圖及其數(shù)據(jù)進行處理，計算得到蛋白質水解物的相對分子質量大小及分布范圍，進而得到相對分子質量小于1000u的蛋白質水解物(包括低聚肽和少量游離氨基酸)所占比例。

　　本法適用于以海洋魚皮、魚骨或魚肉為原料，用酶解法生產(chǎn)的，相對分子質量低于1000的低聚肽(短肽)為主要成分的粉末。

　　三、蛋白質的含量測定方法

　　蛋白質的含量測定是生化藥品研究最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的測定方法有凱氏定氮法、福林酚法、雙縮脲法、BCA法、考馬斯亮藍法、紫外分光光度法及熒光法?！稓W洲藥典》6.0版、《英國藥典》2009年版及《美國藥典》32版附錄中均收載了上述七種方法，《中國藥典》2005年版三部附錄僅收載了上述測定方法中的前三種。以下僅供參考：

　　3.1 凱氏定氮法：

　　原理：本法系依據(jù)蛋白質為含氮的有機化合物，當與硫酸和硫酸銅、硫酸鉀一同加熱消化時使蛋白質分解，分解的氨與硫酸結合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸液吸收后以硫酸滴定液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以氮轉化為蛋白質的換算系數(shù)，即為蛋白質的含量。凱氏定氮法雖耗時較長，但它是蛋白質測定方法中最經(jīng)典的測定方法，本法所測的結果為蛋白質絕對濃度而非相對濃度，可用于標準蛋白質含量的準確測定。

　　3.2  福林酚法：

　　原理：本法系依據(jù)蛋白質分子中含有的肽鍵在堿性溶液中與 Cu 2 + 螯合形成蛋白質- 銅復合物，此復合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產(chǎn)生藍色化合物，同時在堿性條件下酚試劑易被蛋白質中酪氨酸、 色氨酸、 半胱氨酸還原呈藍色反應，在一定范圍內其顏色深淺與蛋白質濃度呈正比，以蛋白質對照品溶液作標準曲線，采用比色法測定供試品中蛋白質的含量。

　　3.3  雙縮脲法：

　　原理：本法系依據(jù)蛋白質分子中含有的兩個以上肽鍵在堿性溶液中與 Cu 2 + 形成紫紅色絡合物， 在一定范圍內其顏色深淺與蛋白質濃度呈正比，以蛋白質對照品溶液作標準曲線， 采用比色法測定供試品中蛋白質的含量。

　　3.4  Bradford法(考馬斯亮藍法)：

　　原理：考馬斯亮藍(CBB)測定蛋白質含量屬于染料結合法的一種?？捡R斯亮藍在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm;當它與蛋白質結合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質—色素結合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質含量成正比，因此可用于蛋白質的定量測定。蛋白質與考馬斯亮藍結合在2min左右的時間內達到平衡，完成反應十分迅速;其結合物在室溫下1h內保持穩(wěn)定。該法試劑配制簡單，操作簡便快捷，反應非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測定微克級蛋白質含量，測定蛋白質濃度范圍為0～1 000μg/ml，是一種常用的微量蛋白質快速測定方法。

　　四、小結:

　　小肽 (二肽、三肽)作為蛋白質的主要消化產(chǎn)物，在氨基酸消化、吸收和代謝中起著重要作用。但酵母水解物與小麥水解蛋白、大豆肽粉等專屬的肽類蛋白原料不同，它還含有核酸、多糖等其他大分子(約30%以上)。而且小肽的含量與酶解所用的酶制劑、添加比例、酶解時間、溫度、pH值等均有一定的相關性，檢測時在樣品處理、國標、行業(yè)標準、實驗室常用檢測方法等方面，尚缺乏系統(tǒng)、精確、可重復性的檢測方法方面的公開報道。而且，酵母水解物作為一種強誘食性的蛋白原料，只有以新鮮酵母為原料，經(jīng)充分水解、干燥后才能呈現(xiàn)特有的鮮味，品控重點應以產(chǎn)品使用價值為目標，以《飼料原料目錄》中強制標識要求為根據(jù)。

　　因此，我們暫時不建議將小肽作為酵母水解物的常規(guī)指標加以評估，而應該將方便飼料企業(yè)檢測、且能反應出產(chǎn)品品質的指標，如粗蛋白、氨基酸態(tài)氮、核酸、甘露聚糖、水分、灰分等作為常規(guī)品控指標。

　　以上觀點僅代表湖北海宜，不足之處還望同行及用戶多多包涵，并歡迎共同探討!